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总RNA快速抽提试剂盒
产品说明:
超纯总RNA提取试剂盒是经过改进开发的新一代产品,提高了裂解液的裂解能力和提取的灵敏度,同时通过可在特定适宜的条件下特异、可逆地结合RNA,而各种蛋白质和其他杂质均可被去除掉对硅基质膜的改进增强了对RNA的吸附能力,得到的RNA 纯度更好,质量更高。该试剂盒可从各种细胞或组织中快速提取总RNA,每个吸附柱每次可处理50–100 mg 组织或5×106 细胞,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA 没有DNA 和蛋白的污染,可用于Northern blot、Dot blot、polyA 筛选、体外翻译、RNase 保护分析和分子克隆。
试剂盒组成、储存、稳定性:

试剂盒组成
保存
50
裂解液RL
4℃避光
50 ml
去蛋白液RE
室温
25 ml
漂洗液RW
室温
10 ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free H2O
室温
10 ml
70%乙醇
室温
9ml RNase-free H2O
第一次使用前按说明加指定量乙醇
RNase-free吸附柱RA
室温
50个
收集管(2ml)
室温
50个

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:
1.  所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2.  不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。裂解液RL可以常温运输,收到后4避光保存
3.   避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
适用范围:
适用于快速提取各种动植物组织/细胞高纯度总RNA
产品特点:
1.  离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.  结合了异硫氰酸胍/酚一步法试剂稳定性好,纯度高和离心柱方便快捷的优点,不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程,RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
3.  独有的RL裂解液配方,可以有效的消除基因组污染。
4.  多次漂洗去蛋白过程,提取RNA纯度更高。
5.  有效的去除了5S在总RNA中含量,提高了纯度。
注意事项:
1.  第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇,加入后请及时打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2.  为防止RNA降解,所有离心步骤如未加说明,均在4℃低温进行。使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3.   裂解液RL和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4.  考虑到环保问题,本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿,用户使用前需要自备氯仿。
5.  常规的琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳均可以用来分析RNA的质量。好的RNA产物在电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体RNA带,分别为~5Kb(28S),~2Kb(18S),条带亮度比值约为2:1。有时候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S,tRNA)带。但有时候根据不同的物种如某些植物组织可以看到4,5条带也属于正常现象,如果RNA未成熟的前体或者不均一核RNA、小核RNA提取出来也可能看到介于7Kb和15Kb之间的不连续的高分子量条带。
6.  检测OD260/OD280吸光度比值时,RNA样品应该溶于TE后检测,如果用水稀释后检测,由于一般水离子强度和PH值低,会使OD280升高,从而使比值降低。
7.  加入裂解液RL匀浆后,加氯仿前,样品可在 –60℃-70℃ 保存一个月以上。
操作步骤:(实验前请先阅读注意事项)
提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量乙醇!
1.  匀浆处理
a.   组织
用玻璃或强力匀浆器搅匀组织样品,保存于液氮内样品需要用研钵磨碎,每50~100mg组织加1ml的裂解液RL后匀浆。组织样品容积不能超过RL容积的10%。
b. 单层生长的细胞
直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的RL溶解细胞,并用移液枪轻轻吹打混匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的RL量(每10cm2加1ml)。一般情况下,普通大小的细胞培养瓶,加入1ml的RL, 迅速轻摇使RL充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活RNA酶,轻轻用移液枪反复吹打混匀。当RL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。
c. 悬浮生长的细胞
通过离心来沉淀细胞。在RL试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。每5~10×106的动物细胞,植物或酵母菌细胞或每1×107细菌加1ml的RL。在加入RL前应避免洗涤细胞,否则会增加mRNA降解的可能性。破裂某些酵母菌和细菌可能需要使用匀浆器。
2.  将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15 -30°C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
3.  可选步骤:4°C的条件下12,000rpm 离心10分钟,小心取上清转入一个新的RNase free的离心管中。当样品富含蛋白质、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉。脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000rpm离心10分钟,移除匀浆中不溶解的物质,余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA,而上层的超浮游物含有RNA。
4.  每1mlRL加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
5.  于4℃12,000rpm 离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RL体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
6.   加入1倍体积70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!,颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
7.  12,000rpm 离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
8.  加500μl 去蛋白液RE,12,000rpm 离心45秒,弃掉废液。
9.  加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!,12,000 rpm 离心45秒,弃掉废液。
10.  加入500μl漂洗液RW,12,000 rpm 离心45秒,弃掉废液。
11.  将吸附柱RA放回空收集管中,13,000 rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12.  取出吸附柱RA,放入一个RNase free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl RNase free water(事先在 65-70℃水浴中加热效果更好), 室温放置2分钟,  12,000 rpm 离心1分钟。如果需要较多RNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,离心1分钟,或者另外再加30μl RNase free water,离心1分钟,合并两次洗脱液。
洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要RNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积, 但是最小体积最好不少于30μl,体积过小降低RNA洗脱效率,减少RNA产量。
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